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長期食用开菲尔Kefir(芯蕊康)可溶性、非活菌成分會減少脂質沉積在LDLr-/-小鼠

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長期食用开菲尔Kefir(芯蕊康)可溶性、非活菌成分會減少脂質沉積在LDLr-/-小鼠【摘要】目標:克菲爾發酵乳是由多株乳酸菌和酵母菌組成的共生菌相-開菲爾粒發酵製成。在臨床上,開菲爾發酵乳已因其抗發炎、胃腸道保健、心血管保健、或綜合性功能而被科學家推薦做為健康促進之超級食物。其中,最為人矚目的即其在心血管保健之功效。但目前尚缺乏明確證據驗證其於動脈粥狀硬化預防與控制之應用可能性。本文透過LDLr

長期开菲尔Kefir(芯蕊康)可溶性、非菌成分會減少脂質沉積在LDLr-/-小鼠

摘要

目標:克菲爾發酵乳是由多株乳酸菌和酵母菌組成的共生菌-開菲爾粒發酵成。在臨床上,開菲爾發酵乳已因其抗發炎、胃腸道保健、心血管保健、或綜合性功能而被科學家推薦做為健康促進之超級食物。其中最為人矚目的即其在心血管保健之功效。目前缺乏明確證據驗證其於動脈粥狀硬化預防與控制之應用可能性。本文透過LDLr-/-高膽固醇疾病模式證實長期食用開菲爾發酵乳中可溶性非細菌成分可減緩動脈粥狀硬化進展

方法: LDLr-/-小鼠以隨機方式為一般飼料餵養且未施以任何處理(ND)高脂飼料飼養但未施以其他處理小鼠(HD)、以高脂飼料餵養且以牛乳中水溶性成分進行管餵小鼠(HD-Milk)、與以高脂飼料飼養且以開菲爾發酵乳代謝產物進行管餵之小鼠(HD-Kefir)等四組各組小鼠經上述飼養與處理方法四週後,採集血清分析膽固醇和細胞激素測量變化輛;另外,收集大動脈並以油洪染色進行巨觀與組織病理觀察,分析大動脈中脂質沉積情形。

結果:開菲爾發酵乳中可溶性之非細菌成分可使LDLr-/-小鼠在高膽固醇情況下減少血管中脂質沉積。進一步分析發現開菲爾發酵乳代謝產物主要可使小鼠血清中的發炎前驅物 IL-6TNF-α表現亮分別減少50%42%抗發炎細胞素IL-10之表現增加72%

結論:長期食用開菲爾發酵乳中之代謝產物可應用於減少LDLr-/-高膽固醇疾病模式小鼠體內之動脈粥狀硬化,進一步分析得知係透過調節循環系統中發炎相關細胞激素表現,但仍無發排除代謝產物其他生物活性之貢獻。本文獻提供開菲爾發酵乳預防醫學應用之新論點結果顯示開菲爾發酵乳中的活性胜肽極具應用於預防動脈粥狀硬化之潛力

【关键词】开菲尔;益生菌;低密度脂蛋白;动脉粥样硬化;细胞因子

Chronic administration of the soluble, nonbacterial fraction of

kefir attenuates lipid deposition in LDLr/ mice

Adrielly F. Santanna M.A.  a, Placielle F. Filete M.A. a, Ewelyne M. Lima Ph.D. a

,Marcella L. Porto Ph.D. b,c, Silvana S. Meyrelles Ph.D. b, Elisardo C. Vasquez Ph.D. a,b

,Denise C. Endringer Ph.D. b, Dominik Lenz Ph.D. b, Dulcineia S.P. Abdalla Ph.D. d

,Thiago M.C. Pereira Ph.D. a,c, Tadeu U. Andrade Ph.D. a,*

Abstract】Objectives: Kefir is obtained by the action of acidic bacteria and yeasts that exist in symbiotic association in kefir grains. Recently, this fermented milk drink has been recommended for the

treatment of several clinical conditions, such as inflammatory, gastrointestinal, or cardiovascularrelated diseases, or a combination of these diseases. However, its effects on atherosclerosis are not

yet clear. The aim of this study was to prove that chronic treatment with a soluble, nonbacterial

fraction of kefir could reduce the progression of atherosclerosis in low-density lipoprotein receptor–deficient (LDLr/) mice.

Methods: LDLr/ mice were divided into four groups as follows:

1. The normal diet group received a normal diet without treatment.

2. The high-fat diet (HD) group received a high-fat diet without treatment.

3. The HD-milk group received a high-fat diet and was orally treated with 22 mL/kg of the

vehicle.

4. The HD-kefir group received a high-fat diet and was orally treated with soluble, nonbacterial

fraction of kefir (22 mL/kg) for 4 wk. At the end of experiment, blood was collected to

measure cholesterol and cytokines, and the aorta was collected to evaluate the lipid deposition

by en face analysis.

Results: The soluble, nonbacterial fraction of kefir reduced lipid deposition (P < 0.05) independent

of hypercholesterolemia. Moreover, kefir was capable of diminishing the circulating proin-

flammatory intereukin (IL)-6 level and the ratio of tumor necrosis factor-a to IL-10 (50% and 42%,

P < 0.05, respectively) and augmenting the antiinflammatory IL-10 level by approximately 74%

(P < 0.05).

Conclusions: Chronic treatment with a soluble nonbacterial fraction of kefir was able to decrease

the lipid deposition in LDLr/ hypercholesteremic mice, at least in part through modifying the

circulating cytokine profile. The beneficial effects of kefir provide new perspectives for its use as an

adjuvant in the prevention of atherosclerosis.

Keywords:KefirProbioticsLDLr/AtherosclerosisCytokines

二、前言

    動脈粥狀硬化為大動脈持續發炎衍生之病變,並且易造成心血管疾病與死亡。病變肇因於血管內皮細胞異常,此外伴隨血管中氧化壓力升高、發炎反應活化脂質沉澱累積而逐漸惡化;此外,近來流行學研究發現了其他與動脈硬化進展相關之分子機轉、細胞生理調控、與環境風險因子等,讓我們逐漸了解動脈硬化之真面目,並為該疾病之治療或預防帶來曙光

    近年來,許多科學研究或臨床試驗紛紛揭露機能性食品於預防動脈粥狀硬化之潛在價值,包含具有益生菌之發酵乳(包含開菲爾發酵乳)已有研究團隊提出開菲爾發酵乳所含成分具有如降血脂、抗發炎、抗氧化、免疫調節和抗基因毒性等多種生物活性,但未有證據證實長期食用開菲爾乳對於預防動脈粥狀硬化之影響另有其他文獻證實發酵乳中衍生胜肽具有多種生物活性如抗菌、類嗎啡、降高血壓、抗血栓和免疫調節等。因此本團隊相當希望進一步研究開菲爾發酵乳中可溶性之非活菌部分(以下稱開菲爾發酵乳代謝產物)是否同樣具有傳統開菲爾發酵乳健康促進功能。

    目前動脈粥狀硬化研究範疇中科學家主要係利用遺傳編輯之老鼠建立動脈粥狀硬化疾病模式,進一步研究動脈硬化之分子與細胞機轉,並試圖開發可做為預防或治療動脈硬化素材。其中,利用高脂飼料餵養之LDLr-/-小鼠可誘發小鼠產生高膽固醇與動脈粥狀硬化等病症,同時伴隨血清高密度脂蛋白以外之其他脂蛋白含量(主要為低密度脂蛋白)異常升高,是一種研究動脈粥狀硬化致病機轉與開發抗動脈硬化素材之理想疾病動物模式。本研究證實,透過長期服用開發爾發酵乳中代謝產物可避免LDLr-/-高膽固醇疾病模式鼠大動脈中粥狀硬化之進展。實驗結果顯示開菲爾發酵乳中代謝產物對於控制血管內脂質沉積有益的影響,並提出可能參與其中的機制。

 

三、材料與方法

3.1實驗動物:

    本實驗選用利用21~25公克重的公鼠,飼育在Vila Velha大學實驗監控的動物安護設施中。小鼠以獨立塑膠飼養箱飼養,環境控制在溫度攝氏22度以及相對濕度60%,並以12小時/12小時黑暗的規律作息下。所有飼養照顧程序和實驗進行步驟都遵照國家健康機構的規範,而研究方法都經過動物照護委員會認證。為了誘發高血脂與動脈粥狀硬化,12週齡大的LDLr-/-小鼠以Western-type飼料餵食4週。LDLr-/- 小鼠隨後被隨機分成四個組別(a)ND-以一般飼料餵養且無其他處理、(b)HD-以高脂飼料飼養但未施以其他處理(c)HD-Milk-以高脂飼料餵養且以牛乳中水溶性成分進行管餵小鼠(酸鹼值調整到4.0,以22 mL/Kg體重之劑量管餵)(d)HD-kefir以高脂飼料飼養四週且以開菲爾發酵乳可溶性非細菌的成分進行管餵之小鼠

3.2 開菲爾發酵乳製備

    實驗中所用開菲爾是用巴西民間常用的開菲爾粒發酵製成。發酵過程中,以巴斯德式滅菌處理的牛奶添加4%的開菲爾粒,以室溫環境下進行發酵達24小時,過篩分離開菲爾粒後,剩餘之開菲爾發酵乳以8℃培養24小時讓酵母菌生長。根據文獻揭露之方法製備可溶性的非活菌成份,流程如下:將發酵乳以98℃處理10分鐘,再以4℃、9000g離心10分鐘去除發酵乳中不可溶的部分。一般未發酵乳品的酸鹼值大約在pH6.8,因為發酵過程中有乳酸菌的參與,發酵完後大約酸鹼值降為pH4.0,因此用於HD-Milk組餵食的牛奶水溶性成分也以冰醋酸調整為pH4.0,排除酸鹼值之影響。

3.3 血清脂質分析

    小鼠施打過量的麻醉劑(氯胺酮)而犧牲,利用右心室穿刺方式採集血液樣本,以3000g離心10分鐘分離採集的血液,收集的血清保存於在攝氏-80。血清中的膽固醇和高密度脂蛋白以自動生化分析儀,並將總膽固醇含量扣除高密度脂蛋白含量,即為非高密度脂蛋白。

3.4 動脈型態分析脂質沉積情況

    依照文獻揭露方法進行脂質沉積分析。LDLr-/-小鼠犧牲後,利用磷酸鹽緩衝液來沖洗心臟與循環系統。取下主動脈竇後利用油紅染色來觀察中性脂質。定量分析則是利用NIH影像軟體(Image-J 1.35 d; NIH, Bethesda, MD, USA)

3.5 血清中細胞激素分析

    利用流式細胞儀檢測血清中的細胞激素(IL-6.-10.-12、TNF-αIFN-γ)和趨化因子(MCP-1)。細胞激素磁珠微陣列是利用流式細胞儀放大檢測螢光時的靈敏度,可同時測量單一樣品中不同的可溶分析物,每個粒子都會用免疫標定的方式來分析。結果依照儀器的建議使用FACSCanto IIFACSDiva軟體分析。藉由重組細胞激素的標準曲線來比較樣品,定量出結果,單位是每毫升多少皮克,TNF-α/IL-10的比值也可以被算出來。

 

四、實驗結果

4.1 血脂分析

    與一般飼料餵食的ND組小鼠相比,所有經高脂飼料餵養之小鼠(包含HDHD-MilkHD-Kefir)均可觀察到血清中總膽固醇與非HDL之脂蛋白含量顯著增加,但未影響血清中HDL含量。HD-MilkHD-Kefir兩組小鼠結果顯示,牛奶水溶性成分以及開菲爾發酵乳水溶性非活菌成份(以下稱開菲爾代謝產物)處理均未改變高脂飼料飼養造成之高膽固醇現象。

4.2 大動脈脂質沉積之巨觀分析

    四組小鼠主動脈竇採集後以油紅染色來標註管壁沉積之脂質,並進一步進行量化分析。視野下,主動脈竇紅色部位即為沉積的脂質,HD組與HD-milk組小鼠主動脈竇上的油脂沉積現象明顯高於ND;而HD-Kefir組的小鼠雖經高脂飼料餵養,但以開菲爾代謝產物處後改善脂質堆積情形,程度ND組相仿。由量化統計結果可知,HD組與HD-milk組之脂質沉積情形相較於ND組小鼠顯著增加,但若以開菲爾代謝產物處理則可顯著減少脂質沉積。

4.3 細胞激素表現分析

    圖二係以細胞激素磁珠微陣列分析血清中促發炎細胞激素(IL-12p70TNF-aINF-r、與IL-6)與抗發炎細胞激素(IL-10)之表現。結果顯示在諸多促發炎因子中,僅IL-6HDHD-milk兩組小鼠血清觀察到顯著增加之現象,有趣的是,開菲爾代謝產物處理可以降低高脂飼料餵養誘發LDLr-/-小鼠加之IL-6表現達50%。此外,本實驗同時發現餵食開菲爾代謝產物之小鼠與其他三組相比,其抗發炎細胞激素IL-10顯著增加,顯示開菲爾代謝產物有助於抑制發炎反

 

五、討論:  

    我們透過餵食開菲爾代謝產物四週後,發現LDLr-/-小鼠血管中脂質沉積現象有明顯減少現象進一步發現可能是透過免疫調節活性而非降低LDLr-/-小鼠體中過高的膽固醇。在過文獻中,本團隊已提出開菲爾發酵乳應用於心血管保健之能性。其他研究團隊則指出開菲爾發酵乳中的衍生胜肽具有促進心血管保健之生物活性,如降高血壓、抗氧化和免疫調節,且衍生胜肽經由發酵乳中的微生物進一步水解增強其生物活性。另有其他文獻指出具生物活性之胜肽在人體消化系統中可被進一步水解,被吸收至循環系統後抵達週邊組織,進一步在特定器官或全身各處發揮功能。綜上所述,我們希望進一步研究開菲爾發酵乳代謝產物活性與可應用性。

    傳統開菲爾係利用完整開菲爾粒為發酵菌元進行發酵製成,開菲爾粒是由多種乳酸菌、酵母菌、或醋酸菌組成的共生菌相,上述發酵菌種主要棲息於多醣體所組成之外鞘中,並在相當多國家與地區被流傳著。以巴西為例,克菲爾發酵乳的製作與飲用在民間代代相傳,主要是透過家庭手作發酵生產本身所需之發酵乳,尚無商業化量產。雖然在部分國家已有廠商量產名為開菲爾發酵乳之產品,但受限於發酵技術限制,目前商業化產品多是由數種鑑定開菲爾粒之乳酸菌株發酵製成,與傳統由開菲爾粒發酵製成之發酵乳迥異。近來研究紛紛指出,開菲爾發酵乳之生物活性成分的產生需要依賴共生菌相中不同菌株交互作用因此市場上利用分離菌株發酵製成之發酵乳無法還原其多元功能。此外,各地開菲爾因來源、菌相組成、與發酵條件不同,導致產製之發酵乳含有活性成分不同。

    雖然年來研究紛紛指出部分發酵乳具有調節血中膽固醇濃度之功效但現有發表之科學研究或臨床數據皆顯示:開菲爾發酵乳在調節膽固醇之功效仍存在相當爭議! 舉例而言,日本科學家Nakamura利用開菲爾粒鑑定出來的已知乳酸菌進行發酵產生VPP&IPP三胜肽無法改善ApoE-/-小鼠血中膽固醇與三酸甘油脂過高之問題。本實驗結果則顯示,開菲爾代謝產物雖無法改善LDLr-/-小鼠血清中膽固醇含量,但可有效避免動脈粥狀硬化惡化。活性可能是透過代謝產物中所含的衍生胜肽,發揮其抗發炎功效所達到的。

    由科學驗證與人體臨床文獻顯示,身體的慢性發炎是促進動脈粥狀硬化進展的主要因素,而慢性發炎則透過身體內生化調節失控(如氧化型脂蛋白含量增加)或免疫調節失常所致。科學家進一步透過動物實驗清楚地證實慢性發炎發生過程中所牽涉之促發炎細胞激素產生與斑塊形成之關係。目前已之促發炎細胞激素如IL-6IL-12TNF-αIFN-γ等可以誘導內皮細胞中趨化因子(Chemokine)與細胞黏著蛋白之表現,吸引血液中單核細胞與淋巴細胞聚集於內皮細胞下方,這是脂質沉積的初期。其中,單核細胞受聚集區域分泌之細胞激素誘導進一步分化為巨噬細胞甚至是泡沫細(foam cell)泡沫細胞的產生將進一步促進脂蛋白之氧化,加速硬化形成。過去文獻指出減少IL-6表現或TNF-α/IL-10比例可以抑制血管上的脂質沉積。在本實驗中,雖然開菲爾代謝產物無法降低TNF-α含量,但是可以透過增加IL-10降低TNF-α/IL-10比例,達到抑制脂質沉積之功效。其他研究也有發現三胜肽(IPP&VPP)會去抑制細胞激素調控的發炎反應,因此此胜肽或可利用LDLr-/-小鼠進行分析已評估該胜肽於抑制動脈粥狀硬化之可行性。

    2015年曾有德國科學團隊從開菲爾發酵乳中鑑定出257種胜肽,其中236種胜肽是過去從未被發現過的獨特胜肽序列,經過序列比對與文獻討發現部分胜肽跟已知具生物活性序列具有高度同源性,意味著開菲爾胜肽蘊含多元生物活性之可能。本實驗尚無法排除開菲爾代謝產物是否有其他活性如抗氧化參與在改善動脈粥狀硬化。近年來,我們發現開菲爾發酵乳可透過衍生胜肽之抗氧化活性改善自發性高血大鼠血管內皮細胞之功能,我們更進一步鑑定出至少含有VYPFPGPIPNARHPHPHLSFMYQEPVLGPVRGPFPHV三種具抗氧化胜肽。顯示開菲爾代謝產物的衍生胜肽可能透過抗發炎以外之功能協助動脈粥狀硬化控制。除了胜肽之外,開菲爾發酵乳可透過微生物發酵產其他如丁酸這種具有健康促進功能之代謝產物,Aguilar團隊發現透過餵食丁酸可以減緩ApoE-/-小鼠動脈粥狀硬化進展。進一步分析發現餵食丁酸調節發相關因子而非調降過高膽固醇,達到減緩動脈粥狀硬化惡化,與本文實驗結果相符。其中,丁酸可調降促發炎因子(IL-6)並活化抗發炎因子(IL-10)之表現,亦與本實驗結果相同不僅意味著開菲爾代謝產物中具有抗動脈硬化功效的成分可能不只一種,更顯示抑制血管發炎遠比一昧控制高膽固醇含量更可取得抑制動脈粥狀硬化之效。

    然而,本實驗尚未進一步釐清在開菲爾代謝產物中之各性成分之組成。雖然透過現有文獻可猜測其主要抑制動脈硬化之活性主要可能來自於活性胜肽,但仍無法排除其他產謝產物參與之可能性。因此,未來仍需要更多進一步的研究來釐清代謝產物中究竟哪些成分是最適合進一步開發用為動脈粥狀硬化控制之用。

 

六、結論

本實驗可證實長期食用開菲爾代謝產物可避免LDLr-/-高膽固醇疾病模式小鼠血管中之脂質沉積,主要係透過調節血清中各種發炎相關細胞激素表現而非調降過高之膽固醇。未來若有更多研究釐清當中功能性胜肽之活性與作用機轉,開菲爾代謝產物是相當適合作為動脈粥狀硬化患者使用的機能性食品

参考文献:

[1] Galkina E, Ley K. Immune and inflammatory mechanisms of atherosclerosis

(*). Annu Rev Immunol 2009;27:165–97.

[2] Vasquez EC, Peotta VA, Gava AL, Pereira TM, Meyrelles SS. Cardiac and

vascular phenotypes in the apolipoprotein E-deficient mouse. J Biomed Sci

2012;19:22.

[3] Leal MA, Balarini CM, Dias AT, Porto ML, Gava AL, Pereira TM, et al.

Mechanisms of enhanced vasoconstriction in the mouse model of atherosclerosis: The beneficial effects of sildenafil. Curr Pharm Biotechnol

2015;16:517–30.

[4] Lusis AJ. Atherosclerosis. Nature 2000;407:233–41.

[5] Pereira TM, Nogueira BV, Lima LC, Porto ML, Arruda JA, Vasquez EC, et al.

Cardiac and vascular changes in elderly atherosclerotic mice: the influence

of gender. Lipids Health Dis 2010;9:87.

[6] Libby P, Hansson GK. Inflammation and immunity in diseases of the arterial

tree: players and layers. Circ Res 2015;116:307–11.

[7] Kleemann R, Verschuren L, Morrison M, Zadelaar S, van Erk MJ,

Wielinga PY, et al. Anti-inflammatory, anti-proliferative and antiatherosclerotic effects of quercetin in human in vitro and in vivo models.

Atherosclerosis 2011;218:44–52.

[8] Lou-Bonafonte JM, Arnal C, Navarro MA, Osada J. Efficacy of bioactivecompounds from extra virgin olive oil to modulate atherosclerosis

development. Mol Nutr Food Res 2012;56:1043–57.

[9] Uchida M, Ishii I, Inoue C, Akisato Y, Watanabe K, Hosoyama S, et al. Kefiran

reduces atherosclerosis in rabbits fed a high cholesterol diet. J Atheroscler

Thromb 2010;17:980–8.

[10] Gomes IB, Porto ML, Santos MC, Campagnaro BP, Gava AL, Meyrelles SS,

et al. The protective effects of oral low-dose quercetin on diabetic nephropathy in hypercholesterolemic mice. Front Physiol 2015;6:247.

[11] Reiner MF, Stivala S, Camici GG, Beer JH. [The effects of Omega-3 fatty acids

in clinical medicine]. Praxis (Bern 1994) 2014;103:329–35.

[12] Panahi Y, Khalili N, Hosseini MS, Abbasinazari M, Sahebkar A. Lipidmodifying effects of adjunctive therapy with curcuminoids-piperine combination in patients with metabolic syndrome: results of a randomized

controlled trial. Complement Ther Med 2014;22:851–7.