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克弗爾Kefir(芯蕊康)降低氧化壓力以減緩糖尿病疾病模式大鼠的腎損傷

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【摘要】:
一氧化氮37(2014)53–60克弗爾Kefir(芯蕊康)降低氧化壓力以減緩糖尿病疾病模式大鼠的腎損傷GiovanaR.Punaroa,FabianeR.Maciela,AdelsonM.Rodriguesa,MarceloM.Rogeroc,CristinaS.B.Bogsand,MariceN.Oliveirad,SilviaS.M.Iharab,SergioR.R.Araujob,Tali

一氧化氮 37 (2014) 53–60

克弗爾Kefir(芯蕊康)降低氧化壓力以減緩糖尿病疾病模式大鼠的腎損傷

Giovana R. Punaro a, Fabiane R. Maciel a, Adelson M. Rodrigues a, Marcelo M. Rogero c,Cristina S.B. Bogsan d, Marice N. Oliveira d, Silvia S.M. Ihara b, Sergio R.R. Araujo b,Talita R.C. Sanches e, Lucia C. Andrade e, Elisa M.S. Higa a,

aDepartment of Medicine, Universidade Federal de Sao Paulo, Sao Paulo, Brazil

bDepartment of Pathology, Universidade Federal de Sao Paulo, Sao Paulo, Brazil

cDepartment of Nutrition, Public Health College, Universidade de Sao Paulo, Sao Paulo, Brazil

dDepartment of Biochemical and Pharmaceutical Technology, Universidade de Sao Paulo, Sao Paulo, Brazil

eDepartment of Nephrology, Universidade de Sao Paulo, Sao Paulo, Brazil

 

摘要研究克弗爾發酵乳糖尿病個體體內氧化壓力調節與避免腎損傷之應用團隊利用鏈脲佐菌素誘導韋斯雄性成年大(Wistar rats)產生糖尿病之疾病模型是研究糖尿病的重要疾病模式之一將大鼠分為四組:對照組(CTL組)、餵食克弗爾正常鼠組(CTLK組)、糖尿病疾病模式大鼠組(DM組)、餵食克弗爾糖尿病疾病模式大鼠組(DMK組)鏈脲佐菌素誘導建立糖尿病疾病後第五天開始餵食克弗爾,每日劑量為1.8毫升,餵食期間長達八周。開始餵食克弗爾前後,每隻即獨飼養於代謝籠採集血液及尿液樣本分析尿素、肌酐、尿蛋白、一氧化氮、硫代巴比妥酸活性物質(TBARS)、及C-反應蛋白(CRP, C-Reactive Protein)犧牲後,分析其皮質組織病理變化、氧化壓力與一氧化氮生成。與CTL組相比,DM組大鼠之血糖、血漿中尿素、蛋白尿、腎組織中一氧化氮、超氧游離基(一種自由基)TBARS(細胞膜脂質過氧化指標)及血漿CRP顯著上升;並且觀察到尿液中尿素、肌酐及一氧化氮含量下降,意味著糖尿病造症成功且衍生腎臟功能受損,但餵食克弗爾的DMK組大鼠在部分的數值有顯著的進步。在體內一氧化氮生成部分,各組大鼠體內eNOS含量並無明顯不同,但可發現DMK組大鼠腎臟中誘導式一氧化氮合成酶(iNOS)的表現顯著下降。由於在糖尿病患體中,腎臟一氧化氮上升與腎臟惡化有關,餵食克弗爾後降低腎臟一氧化氮含量,顯示可能有助於延緩腎臟代謝異常。此外,餵食克弗爾的DMK組大鼠之腎小管內的糖基化積累情形與DM組相比也有顯著下降之情形。本實驗結果顯示克弗爾可提供給糖尿病患者作為藥物控制外的輔助營養配方,它協助控制血糖代謝,舒緩體內氧化壓力上升與腎組織糖基化,進而維護腎功能,建議可用於糖尿病患者日常營養補充來延緩糖尿病併發症的惡化。

关键词:克弗尔;氧化应激;一氧化氮;糖尿病与肾功能

Introduction

Diabetes mellitus has become a serious public health problem that affects millions of individuals worldwide. The World Health Organization predicts that 439 million people will have this disease in 2030, and Brazil was listed 5th of 10 countries estimated to have the highest number of people with diabetes, affecting approximately 12.7 million Brazilians in 2030 [1]. Hyperglycemia and oxidative stress have been closely linked to diabetic complications, such as neuropathy, retinopathy and nephropathy. Additionally, excessively high blood glucose levels lead to the increased production of reactive oxygen species (ROS), such as hydrogen peroxide and superoxide radicals [2]. A chronic hyperglycemic state may also cause ROS increases via glucose auto-oxidation in various tissues, leading to high oxidative/nitrosative stress with subsequent impaired nitric oxide (NO) bioavailability. NO is a potent, endogenous vasodilator that modulates renal function and plays a key role in endothelial dysfunction [3]. High levels of ROS contribute to lipid peroxidation (LPO) in cellular membranes, increasing their flfluidity and permeability. Specififically, high levels of ROS generate malondialdehyde (MDA), a highly toxic molecule, and its secondary product, thiobarbituric acid reactive substances (TBARS), which is used as marker of LPO[4].ROS are also responsible for the activation of nuclear factor kappa B (NF-jB), which increases the expression of pro-inflflammatory biomarkers, such as tumor necrosis factor-alpha (TNF-a), and interleukin-6 (IL-6), which augments the expression of C-reactive protein (CRP) [5]. Kefifir is a beverage made from milk that is fermented by a complex mixture of bacteria, including various species of lactobacilli and yeasts. It has been considered a probiotic due to its antioxidant and anti-inflflammatory properties [6,7]. In this study, we investigated the effects of Kefifir on the production of nitric oxide andoxidative stress and renal damage in STZ-induced diabetic rats.

目的

根據世界衛生屬預估,全球糖尿病人口將會在2030年來到約4.4億,且目前中國成人中有超過1.1億名糖尿病患者,屬嚴重的公共衛生議題。高血糖及體內氧化壓力上升與糖尿病患者產生併發症有非常緊密的連結,過高的血糖會造成自由基的產生,導致體內過高氧化壓力/氧化亞硝化壓力,並伴隨體內一氧化氮的生物利用度(bioavailability)下降,無法持續提供血管保護作用,進而造成腎功能損傷。克弗爾是一種發酵乳飲品,且有抗氧化及抗炎的特性。因此本實驗目的是利用糖尿病之動物模型來探討克弗爾對調節體內一氧化氮產生、對抗氧化壓力延緩腎損傷的功效。

 

實驗方法

本實驗用動物共分為四組: 對照組(n=9)、克弗爾餵食正常鼠組(n=9)、糖尿病鼠組(n=12)、克弗爾餵食糖尿病鼠組(n=12)。本實驗從注射STZ誘發第一型糖尿病後的第五天開始餵食克弗爾,每日劑量為1.8ml長達八周時間。餵食克弗爾前後,每隻鼠都獨立關在代謝籠採集血液及尿液樣本並分析尿素、肌酐、尿蛋白、一氧化氮、硫代巴比妥酸活性物質(TBARS)、及C-反應蛋白之數據。八週實驗結束後,犧牲老鼠並取其腎臟做進一步分析。

 

實驗結果

1. STZ誘導第一型糖尿病產生,並衍生腎功能損傷

透過STZ注射成功誘導DM組大鼠罹患糖尿病並餵食克弗爾發酵乳前,可觀察到CTRL組與DM組之間除了血清中TBARS外,其他各項代謝指數(表一)均產生顯著差異,包含飲水與進食量大增,體重顯著下降、空腹血糖值上升、血清中尿素上升、尿液中尿素下降、尿蛋白上升、一氧化氮生成下降等,顯示成功造成糖尿病且導致腎功能下降。

 

2. 食用克弗爾可改善糖尿病疾病模式中各項生理指標與血糖

比較CTL組與CTLK組可發現,餵食克弗爾長達八週的期間內,克弗爾的食用對健康大鼠未產生任何代謝異常與腎功能損壞之情事。對於患有糖尿病個體而言,食用克弗爾可改善飲水量與進食量、排尿異常等問題,但體重下降部分並無明顯改善。若進一步觀察其血糖變化可發現,糖尿病導致空腹血糖值上升,經過克弗爾餵食八周後有助於血糖值之改善(圖二A)。若以口服葡萄糖耐量式驗(OGTT)測試可發現,長期食用克弗爾可以增加個體大量服用葡萄糖後的血糖調節(圖二B)

 

3. 食用克弗爾可改善糖尿病造成腎功能損傷

比較各組血清中與尿液中尿素可發現,雖然DM組與DMK組血清中尿素均高於CTL組,但DMK組大鼠在食用克弗爾長達八周後,其血清中尿素含量顯著低於DM組。相反的DMK組尿液中尿素則顯著高於DM組尿中尿素,顯示食用克弗爾可部分改善糖尿病大鼠的腎功能。此外,在糖尿病患腎臟中腎小管的糖基化累積是進一步造成腎功能受損的原因之一,透過組織病理觀察可發現,STZ誘導產生糖尿病後確實造成腎小管嚴重的糖基化產生,而經過八周食用克弗爾發酵乳後,則可顯著減少腎小管上糖基化之累積(圖二)

 

4. 克弗爾調節糖尿病大鼠體內氧化壓力與炎症

由於過高的血糖與腎小管的糖基化累積均會造成腎臟組織中氧化壓力上升,並且刺激組織產生炎症發生,進而破壞腎臟組織的生理功能,使得糖尿病患逐漸併發慢性腎臟病。本團隊進一步分析在STZ誘導產生糖尿病疾病模式大鼠體內,各項與腎臟組織中氧化壓力、炎症發生相關之生理指標,探討克弗爾發酵乳之角色。

一氧化氮:

各組血漿中一氧化氮含量並不同,然而DM組的一氧化氮釋出量比CTL相較少了7。令人意外的是,食用克弗爾使得CTLK組與DMK兩組的一氧化氮釋出量均與CTL組無異,顯示克弗爾可以有效地維持生物體內產生一氧化氮之能力。此外,比較CTL組與DM組體內一氧化氮與蛋白尿產生呈現強烈反比關係,此為初期腎功能損傷的重要指標(圖三A)。進一步比較腎臟皮質組織中一氧化氮產生量,DM組大鼠腎臟皮質出現大量一氧化氮產生之增加,此現象已知為糖尿病患者體內腎臟受損過程之現象。然而,透過八周的克弗爾發酵乳餵食,可使DMK組大鼠腎臟皮質組織中一氧化氮產生量顯著下降(圖三B),意味著餵食克弗爾發酵乳可減緩糖尿病模式中腎臟受損。為了解各組腎臟皮質組織中一氧化氮變化之機制,團隊進一步利用西式墨點法分析發現各組eNOS的表現量無顯著,但在誘導糖尿病發生後造成iNOS表現上升,且iNOS經過克弗爾餵食後有明顯下降(圖四)

自由基(超氧陰離子):

比較各組腎臟皮質組織中自由基產生發現,DM糖尿病的腎臟皮質組織中自由基產生顯著高於CTL組與TRLK組,而在DMK組則發現餵食克弗爾發酵乳可顯著減少糖尿病誘導後產生的過高自由基,與DM組相較有顯著性的下降。

硫代巴比妥酸活性物質(TBARS):

硫代巴比妥酸活性物質(TBARS)是細胞膜上磷脂質過氧化的分析指標,可用以比較不同組別體內氧化壓力。經分析發現DMTBARSCTL組高出三倍,而在餵食克弗爾發酵乳長達八周後,DMK組大鼠的TBARS數值有明顯下降且接近CTL數值,顯示餵食克弗爾可降低體內氧化壓力。

CRP:

C-反應蛋白(CRP)是腎臟組織中重要的炎症指標因子,在本團隊分析中發現CRPTBARS呈現一樣的趨勢,顯示糖尿病將導致腎臟組織發炎,進一步影響內皮細胞維持並逐漸造成腎功能損傷,但透過克弗爾發酵乳的食用,可以有效改善或避免腎臟炎症發生與損傷。

 

結論

   以克弗爾發酵乳用於治療糖尿病疾病模式鼠的結果顯示,長期食用克弗爾可以較好的血糖控制,透過降低多尿(polyuria)、多渴症(polydipsia)及多食症(polyphagia),改善部分腎功能,如增加一氧化氮釋放降低超氧陰離子(自由基)產生避免脂質過氧化抑制炎症發生。目前推測克弗爾可能透過其中益生菌與其代謝產物如多醣體、有機酸、活性胜肽等達到改善之效果,但其詳細作用機制尚釐清。由過往文獻可知,膳食補充益生菌可以改善腸道菌叢,調節腸道免疫系統進而影響腸道與身體的生理現象,有文獻即指出乳桿菌可延緩第二型糖尿病的發病及降低併發症風險。除了益生菌之外,相關研究也指出:飲食中補充克弗爾能夠增加intestinal bipeptide(腸道雙胜肽)的活性及降低糖的吸收。另外,克弗爾的多醣體(Kefiran)可以降低高血壓大鼠體內過高的血壓及血膽固醇;而患有糖尿病的實驗用兔子中也可發現,克弗爾可降低動脈粥狀硬化的產生。

    本研究發現糖尿病會導致腎臟損傷,但經過長期食用克弗爾可改善部分因糖尿病導致的腎損傷,此結果與過往文獻中結果相符,益生菌能增加腸道菌種代謝能力並釋出氨,進而降低血中尿素氮的濃度,為腎損傷帶來幫助。本研究進一步發現糖尿病鼠體內腎小球的基底膜增加了對尿蛋白的滲透性,但食用克弗爾並未能明顯改善此情況。進一步在各組體內發現對照組與糖尿病鼠的一氧化氮與尿蛋白比例呈現反比,雖然一氧化氮含量在糖尿病導致慢性腎臟病過程中的角色仍待釐清,但相當具有潛力的腎病變指標。進一步亦發現餵食克弗爾的糖尿病鼠之腎小管內的糖基化積累也比對照組的低,這可能是因為食用克弗爾後獲得較佳血糖控制有關。

    目前已知糖尿病患或糖尿病動物模式中,血管內皮對於一氧化氮的生物利用率會因體內高血糖導致的氧化壓力所抑制。主要係因一氧化氮與自由基呈現互相抑制的情況,體內自由基與一氧化氮作用將一氧化氮轉化為過氧化亞硝酸鹽或將自由基轉化為穩定的過氧化氫自由基。本研究

發現糖尿病鼠腎組織內的超氧陰離子(一種重要的自由基)起健康的對照組大鼠高出許多,而經過長期餵食克弗爾可有效降低其含量,顯示克弗爾可有效清除體內自由基,此結果可能由其中活性胜肽所達到。此結果與Ishii團隊發表的結果一致,均顯示糖尿病大鼠體內過高的自由基產生會伴隨腎臟組織中NOS(一氧化氮合成酶)活性上升。在本團隊結果中,糖尿病大鼠排泄中的一氧化氮含量較對照組大鼠為低,但經過克弗爾餵食後可改善此現象。此外,血糖濃度增加也會透過NF-kB訊息傳遞路徑提升iNOS表現量,增加一氧化氮生成並影響更多訊息傳遞路徑,此現象可能是為了拮抗體內氧化壓力升高所導致,在在顯示一氧化氮生成、NOS活性調控、過氧亞硝酸鹽生成等是糖尿病衍生出其他併發症的初期指標。

    本研究中發現糖尿病鼠的過氧化脂增加與血糖升高刺激自由基產生有關。表示過氧化造成的損傷與失去抗氧化特性有關,並導致併發症的產生。本文的克弗爾治療降低了過氧化脂及血糖,進而減少氧化壓力造成的傷害,克弗爾發酵過程中產生的功能性胜肽也可減少自由基的產生及降低過氧化脂。最後,CRP一型及二型糖尿病患的重要指標。本實驗發現糖尿病鼠血清中CRP數值有明顯升高,且克弗爾治療後數值回復到與CTL組接近,可能是因為更好的控制血糖可減少活化NF-kB訊息傳遞路徑與iNOS表現增加。上述結果顯示克弗爾能夠降低腸道表皮細胞的自體免疫反應,並且減少NF-kB訊息傳遞路徑的活化。腸道的滲透性對不管一型或二型糖尿病都是重要指標,增強腸道表皮細胞障蔽(intestinal barrier)或許能夠避免糖尿病發展。基於目前諸多益生菌相關研究尚,未來可設計臨床試驗以提供一用於預防性治療之選擇雖然其中具體機制尚未釐清,但主要作用機轉可能因為降低氧化壓力與免疫及抑制炎症,未來研究可設計針對第一型糖尿病做更有效的治療法。