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克弗尔肽(芯蕊康)对动脉粥样硬化中血管脂质沉积与管壁纤维化之影响

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【摘要】:
《慢性病学杂志》克弗尔肽(芯蕊康)对动脉粥样硬化中血管脂质沉积与管壁纤维化之影响?????????????????????????????????陈小玲,台湾大叶大学?????????胡大一,北京大学人民医院,?【摘要】心血管疾病患病率在现代生活中高油、高盐饮食习惯影响下逐年加剧,各类心血管疾病与并发症更在全球十大死因中占据四项之多。长期摄取过量高脂食物将使血中胆固醇、三酸甘油脂过高,进而诱发血管

《慢性病学杂志》

克弗尔肽(芯蕊康)对动脉粥硬化中血管脂质沉积与管壁纤维化之影响

                                 

小玲台湾大叶大学         胡大一,北京大学人民医院,

 

【摘要】心血管疾病患率在现代生活中高油、高盐饮食习惯影响下逐年加剧,各类心血管疾病与并发症更在全球十大死因中占据四项之多。长期摄取过量高脂食物将使血中胆固醇、三酸甘油脂过高,进而诱发血管炎与动脉粥硬化等病变,最终引发卒中冠心病、慢性肾脏病等病变与死亡。在动脉粥硬化中,血管的脂质沉积与管壁纤维化造成之循环问题与弹性丧失,是造成器官功能丧失与致死之主因。本文献主要系探讨克弗尔肽(KEFPEP)在高脂饮食导致动脉粥硬化形成时,对血管内粥斑块形成与管壁纤维化之影响。研究团队先以高脂饲料喂食诱导ApoE-/-小鼠产生高胆固醇与动脉粥硬化作为疾病模式,再投予不同剂量之克弗尔肽12周,发现低剂量克弗尔肽可在不影响血胆固醇含量情况下改善血管脂质沉积与管壁纤维化;此外,高剂量克弗尔肽则可同步改善高胆固醇与动脉粥硬化之病变。进一步分析可克弗尔肽主要系透过降低血中促发炎因子IL-1βTNF-α表现,并减少血管内皮细胞附黏着蛋白ICAM-1之表现,推测可减少单核细胞附着于血管内皮而引发后续斑块形成。本研究显示克弗尔肽具有多元的生物活性,可应用于调节高血脂患者体内胆固醇异常增加与避免动脉粥硬化产生,适合作为心血管疾病患者使用之能性食品。               

【关键词】动脉粥硬化;克弗尔肽kefir peptides);ApoE-/-小鼠;血管纤维化

 

前言

 

随着饮食习惯的改变,心血管疾病成为现代人普遍常见的疾病,包括卒中、心绞痛、心肌梗等,而多数心血管疾病皆与动脉粥硬化atherosclerosis息息相关。动脉粥硬化为血液中脂质逐渐沉积于血管内皮,造成血栓与管壁纤维化的疾病。在动脉粥样硬化发生初期,氧化压力升高会诱发内皮细胞表现细胞附着蛋白(VCAM-1ICAM-1E-Selectin)与促发炎细胞激素(IL-8MCP-1)使血液中单核细胞黏着于内皮细胞上造成细小伤口,并吸引更多邻近单核细胞聚集于内皮细胞下。聚集的单核细胞将分化为巨噬细胞并进一步演变成泡沫细胞(Foam cell)加速低密度脂蛋白low density lipoprotein, LDL氧化成氧化型低密度脂蛋白oxidized low density lipoprotein, ox-LDL1,2诱发更严重的脂质沉积与管壁纤维化。管壁纤维化使血管逐渐丧失弹性,而脂质沉积造成的血栓影响血液循环,最终诱发卒中、心肌梗等危及生命的严重并发症。文献显示,酵素水解或微生物发酵产生之乳胜肽具有多元的生物活性,包含调节血胆固醇、调节血压、抗血栓、抗氧化、抗炎症、与免疫调节等3,4由于心血管疾病的控制与治疗需要多面向进行,因此多元生物活性的乳胜肽素材用于心血管康复产品之开发

本实验系利用动脉粥硬化模式小鼠进一步探讨,含有丰富活性乳胜肽的开菲尔发酵乳以下称为克弗尔肽, KEFPEP是否可改善血胆固醇、血管炎症、脂质沉积、与管壁纤维化等现象,评价此类新颖保健素材是否适于预防或改善动脉粥硬化之应用

 

材料与方法

1实验材料

1.1实验动物:自Jackson Laboratory购入遗传背景为C57BL/6ApoE-/-小鼠,以SPF条件饲养。在小鼠8周龄时,取体重25-30公克之ApoE-/-公鼠,并随机挑选分组进行试验

1.2克弗尔肽KEFPEP:乳原料搭配完整开菲尔粒发酵并经喷雾干燥制成之发酵乳粉,由台湾中化健康生技公司提供别名芯蕊康

1.3分析试剂:以酶联免疫法测定试剂分析IL-1βAbcam, Cambridge, MA, USATNF-αAbcam, Cambridge, MA, USA)。一般或特殊组织染色试剂包含HematoxylinMerck, Darmstadt, Hesse, Germany)、Eosin YSigma, St. Louis, Missouri, USA)、Oil red-OSigma, St. Louis, Missouri, USA)、Trichrome stain kitScyTek, Logan, Utah, USA用以分析血管组织病理变化

2实验方法

2.1克弗尔肽样品制备与喂食剂量计算

    克弗尔肽原料粉末以去离子水回溶,制备成重量百分比浓度为2.5%10.0%样品两款。八周龄大、体重约25公克之C57BL/6公鼠以随机挑选方式分组,以100微升之低浓度样品(2.5%)与高浓度样品(10.0%)分别进行管喂。低剂量实验组(KL)与高剂量实验组(KH)小鼠之管喂剂量分为100 mg/Kg400 mg/Kg

2.2动物模式的建立及给药

作为对照组之C57BL/6野生型小鼠(B6 control)ApoE-/-小鼠(ApoE control)以一般饲料饲养。其余ApoE-/-小鼠在八周龄时改由高脂饲料喂食,为期12周喂食诱导小鼠体内动脉粥硬化做为疾病对照组(Mock);另有两组ApoE-/-小鼠,以高脂饲料喂食时分别再以管喂方式进行低剂量(100mg/Kg体重)与高剂量(400mg/Kg体重)克弗尔肽处理,做为实验组(KLKH)经过12周处理后,采集小鼠血液后牺牲以进行后续生化、组织病理分析。

*经人体与动物剂量换算公式计算5本实验克弗尔肽喂食剂量相当于60公斤的成年男性食用364.8 mg (小鼠100 mg/kg)1459.5 mg(小鼠400 mg/kg)。

2.3统计学方法

    本实验数据皆以Mean ± SD 表示,以Statistical Product and Service Solutions SPSS统计分析软件做邓肯式多变域检定Duncan’s multiple-range test检测各组间之差异,并以生物统计及科学绘图软件Graphpad prism7绘制图表,而组织切片染色图以Image j定量分析,且各组间统计结果以小写英文字母表示,不同英文字母表示彼此间具有显著性差异存在P < 0.05)。

 

结果

1克弗尔肽改善动脉粥硬化疾病模式之高胆固醇

    ApoE-/-小鼠经高脂饲料饲养12周后采集血液后牺牲。血液样品用于侦测血液中的总三酸甘油脂TG与总胆固醇TC含量。结果显示各组小鼠血清中三酸甘油脂总量均属于正常生理范围内,显示小鼠Apoe基因之剔除与高脂饲料处理皆未诱发高血脂(1)B6 Control比较一般饲料喂养的ApoE-/-小鼠可观察到血胆固醇显著增加,代表Apoe基因之缺陷会造成高胆固醇。若以高脂饲料喂养,将再加剧ApoE-/-小鼠血胆固醇增加幅度P < 0.05)。在高脂饲料喂养期间若以不同剂量克弗尔肽处理,发现高剂量克弗尔肽(KH)可降低ApoE-/-小鼠的血胆固醇,改善高脂饲料造成之影响,但低剂量克弗尔肽则无法改变血胆固醇含量(1)

1、喂食克弗尔肽十二周对小鼠生理数值变化。数据以平均值±标准误差表示(n = 8),各组不含相同的字母代表具有显著性差异(p < 0.05)。

2克弗尔肽减缓ApoE-/- 小鼠动脉粥硬化之脂质沉积

动脉粥硬化过程中最为常见的病理特征即血管内皮上之脂质沉积,目前病理分析方法可利用油红染色(Oil Red Staining)判断主动脉是否有脂质沉积。以高脂饲料喂食12周后,主动脉窦以冷冻切片处理后进行油红染色,相较于B6 Control组小鼠血管内几无脂质堆积,一般饲料饲养的ApoE Control组小鼠血管内则有些许的脂质沉积。若以高脂饲料饲养,将诱发ApoE-/-小鼠(Mock)血管内皮产生明显的脂质沉积(图1A)。以不同剂量克弗尔肽处理高脂饲料喂养之ApoE-/-小鼠,结果显示不同剂量之克弗尔肽对血管内皮上脂质沉积有不同程度的抑制效果(图1A)。油红染色定量图显示,克弗尔肽剂量与功效呈现正相关:高、低剂量克弗尔肽处理之ApoE-/-小鼠均可显著降低血管内皮上之脂质沉淀。其中,高剂量组油红染色情况与Mock组小鼠相仿,显示高剂量克弗尔肽几乎完全阻断高脂饲料造成之脂质沉积(图1B)。上述结果显示高脂饮食于血管内皮造成脂质沉积可透过处理不同浓度克弗尔肽加以抑制,且脂质沉积的抑制效果与克弗尔肽剂量呈现正相关

 

 

 

(A)

(B

1、(A克弗尔肽抑制ApoE-/-小鼠中动脉粥硬化斑块的形成。利用油红染色观察一般饲料与高脂饲料喂养之ApoE-/-小鼠主动脉以及主动脉窦中脂质沉积情况。比例尺:200μm。(BApoE-/-小鼠主动脉窦切片油红染色定量分析。数据以平均值±标准误差表示(n = 6),彼此不含相同字母的两组别间代表其差异具有显著性(p < 0.05)。

3克弗尔肽减缓ApoE-/-小鼠血管管壁纤维化

在动脉粥硬化病变过程中,管壁纤维化的出现将使动脉逐渐丧失弹性,使动脉失去对血压升高之缓冲调节功能。在组织病理分析上,可透过马松三色染色(Masson Tri-chrome staining)来判读组织纤维化。小鼠以高脂饲料或克弗尔肽处理十二周后,将主动脉窦以冷冻切片处理并进行马松三色染色。染色结果可知一般饲料喂养的B6 ControlApoE Control组在血管管壁亦有纤维化,两组之间并无差异。若以高脂饲料喂养ApoE-/-小鼠,将使主动脉窦管壁上的纤维化严重增加(2AMock)惊人的是,低、高剂量克弗尔肽处理均可明显避免管壁纤维化之产生2AKL&KH)。进一步将马松三色染色结果量化显示,高脂饲料喂养之ApoE-/-小鼠主动脉窦管壁纤维化(Mock)显著高于一般饲料喂养的组别,而克弗尔肽之处理可显著降低高脂饮食造成之管壁纤维化情形2BKL&KH,两种剂量在改善管壁纤维化之活性无显著差异

 

 

(A)

(B

 

2、(A克弗尔肽减缓动脉粥硬化疾病模式小鼠之血管管壁纤维化。以马松三色染色观察ApoE-/-小鼠的主动脉窦管壁纤维化程度:蓝色代表纤维化的组织,红色为正常组织。比例尺:200μm。(BApoE-/-小鼠主动脉窦切片马松三色染色之定量分析。数据以平均值±标准误差表示(n = 6),各组不含相同的字母代表两组兼具有显著性差异(p < 0.05)。

4克弗尔肽改善ApoE-/- 小鼠血管炎反应

ApoE-/-小鼠喂食不同饲料与克弗尔肽12周后采集小鼠血液,并利用酶联免疫法测定分析检测全身性血液循环中IL-1βTNF-α的表现量(图3ApoE-/-小鼠血清中促发炎因子表现量与野生型对照组小鼠比较并无显著差异。高脂饲料喂食之ApoE-/-小鼠会造成血清中发炎因子显著增加,此结果显示血管炎症与动脉粥硬化之发生具有相关性。不同剂量之克弗尔肽均可显著降低血清中促发炎因子表现量,显示克弗尔肽能有效降低小鼠体内发炎反应,且高剂量组在抑制IL-1β表现之活性显著优于低剂量组(图3A)。

(A)

(B

 

3、小鼠全身性血液循环中促发炎因子之表现量分析。AIL-1βBTNF-α数据以平均值±标准误差表示n = 8),各组不含相同的字母代表具有显著性差异p < 0.05)。

5 克弗尔肽避免血管内皮表现细胞黏附蛋白ICAM-1

在动脉粥硬化进展初期时,脂质沉积肇因于免疫细胞如单核细胞黏着聚集于内皮细胞内,移动至内皮细胞下方并进一步分化为巨噬细胞、泡沫细胞。过程中,内皮细胞会表现过量的细胞黏附因子如VCAM-1ICAM-1、与E-Selectin等。为了探讨克弗尔肽是否可避免单核细胞血管内皮聚集,本团队收集各组小鼠主动脉组织进行蛋白质萃取,分析上述各蛋白质表现量。由西方墨点法分析结果显示,有别于以一般饲料喂养之B6 ControlApoE Control两组,喂食高脂饲料将使ApoE-/-小鼠动脉组织VCAM-1ICAM-1表现明显增加(图4A)。有趣的是,喂食不同剂量之克弗尔肽均无法有效降低VCAM-1蛋白质表现,但可降低ICAM-1蛋白表现量,低剂量组表现情形与Mock组相仿,而高剂量组与B6 Control组相仿(图4A)。

将蛋白表现结果量化可知,喂食高脂饲料的ApoE-/-小鼠处以高剂量克弗尔肽后出现VCAM-1表现下降趋势,但不具统计意义(图4B此外,喂食高脂饲料之ApoE-/-小鼠以低剂量克弗尔肽处理,可使其组织中ICAM-1表现降低至与ApoE Control组相仿;而高剂量克弗尔肽处理之ICAM-1表现则降低至与B6 Control组相仿,显示克弗尔肽可有效调降动脉粥样硬化模式鼠血管组织中ICAM-1表现量(图4C

(A)

 

(B)

(C)

 

4克弗尔肽ApoE-/-小鼠血管中细胞黏附因子表现量影响。(A)以西方墨点法侦测血管组织中VCAM-1ICAM-1蛋白表现量。(BVCAM-1蛋白表现量之量化图(CICAM-1蛋白表现量之量化图,以总量α-tubulin做为定量基准。数据以平均值±标准误差表示(n = 8),各组不含相同的字母代表具有显著性差异(p < 0.05)。

 

讨论

目前心血管患者主要以他汀类药物控制过高的血脂与胆固醇,但却无法充分避免动脉粥硬化发生与恶化,因此目前仍缺乏相关药物与保健素材。在动脉粥硬化过程中,脂质累积形成的血栓与管壁纤维化是常见病征,易引发卒中、心肌梗等危及生命的并发症。部分乳胜肽已知含有2-3种以上不同生物活性,如降胆固醇、调节血压、抑制血管炎症、降低氧化压力、抗血栓、免疫调节等,均与动脉粥硬化之发生与恶化息息相关,因此乳胜肽相当适合应用于预防或控制动脉粥硬化。

近年来,克弗尔肽中的乳酸菌被指出可透过改变肠道菌丛调整体中胆固醇,而发酵乳中的代谢产物经动物实验证实可避免动脉粥硬化过程中的脂质累积与抑制血管炎。为了探讨克弗尔肽发酵乳中代谢产物如活性胜肽在预防或减缓动脉粥硬化之潜在功效,本研究以高脂饲料诱发ApoE-/-小鼠产生动脉粥硬化作为疾病动物模式,分析克弗尔肽之生物活性。结果显示高剂量克弗尔肽可有效降低血胆固醇与避免动脉的脂质沉积及管壁纤维化。另一方面,低剂量克弗尔肽虽无法降低ApoE-/-小鼠过高的血中胆固醇,但却可明显减少脂质沉积与管壁纤维化。其他团队研究显示:三胜肽VPP/IPP作用于同为高脂饲料的ApoE-/-小鼠,虽无法降低血胆固醇但可改善内皮的脂质沉积6。综合上述结果可知,血胆固醇虽为动脉粥硬化之风险因子之一,但降低胆固醇与减缓动脉粥硬化间并非绝对相关。此外,本团队透过专利产程生产之克弗尔肽含有传统开菲尔发酵乳未有之胜肽序列组成,显示此专利原料独特的功效胜肽除了良好预防动脉粥硬化外,更可进一步协助血胆固醇的控制。

团队进一步分析小鼠血清中促发炎因子如IL-1βTNF-α等细胞激素表现,结果显示上述两种促发炎因子表现量都在动脉粥样硬化硬化开始后(Mock)急遽上升,而以克弗尔肽处理则可有效降低促发炎因子表现,且抑制发炎活性与剂量呈现正相关。由于低剂量开菲尔可在未改变血胆固醇含量情况下改善动脉粥硬化,显示克弗尔肽很可能是透过抑制血管炎症达到避免动脉粥硬化恶化,但是否仍有其他原因涉及其中,仍需更多研究加以厘清

动脉粥硬化过程,VCAM-1ICAM-1P-selectin是调控免疫细胞聚集于血管内皮的重要蛋白,其中,内皮细胞的炎信息路径启动可以活化上述蛋白表现,借以吸引单核细胞聚集于内皮细胞。在动脉硬化发生时,VCAM-1ICAM-1表现量之异常上升所代表的意涵不同。文献指出,ApoE-/-小鼠血管内皮之ICAM-1表现情况与动脉粥硬化恶化程度有关,内皮组织或血清中ICAM-1表现均与动脉粥样硬化进展呈现正相关7。相较之下,VCAM-1是在动脉粥硬化发生初期率先被诱导表现的细胞黏附蛋白8,9。由本实验可知,不同剂量的克弗尔肽可抑制血管中ICAM-1之表现量,显示克弗尔肽可能透过抑制血管炎症来减少ICAM-1之表现,避免单核细胞聚集后引发脂质累积与血栓形成。此外,低剂量克弗尔肽无法影响VCAM-1表现,但高剂量组则出现抑制内皮细胞VCAM-1表现之趋势,显示高剂量克弗尔肽除了可以减缓动脉粥样硬化进展外,更可能有助于避免动脉粥样硬化发生,但仍需更多实验验证。

    过本研究可知克弗尔肽是一种富含多种有益于心血管保健生物活性之素材,主要系透过抗发炎之机制避免动脉粥硬化初期发生之单核细胞聚集、脂质累积,与管壁纤维化等。此外,开菲尔已为人类社会食用近千年,极具长期食用之安全性。未来若可累积更多研究克弗尔肽作用于血管组织之整体面貌,将可提供国人一新颖、全面之心血管照护素材

 

 

參考文獻

1Parthasarathy, S., Raghavamenon, A., Garelnabi, M. O. & Santanam, N. Oxidized low-density lipoprotein. Methods Mol Biol 610, 403-417, doi:10.1007/978-1-60327-029-8_24 (2010).

2Steinl, D. C. & Kaufmann, B. A. Ultrasound imaging for risk assessment in atherosclerosis. Int J Mol Sci 16, 9749-9769, doi:10.3390/ijms16059749 (2015).

3Prado, M. R. et al. Milk kefir: composition, microbial cultures, biological activities, and related products. Front Microbiol 6, 1177, doi:10.3389/fmicb.2015.01177 (2015).

4Guzel-Seydim, Z. B., Kok-Tas, T., Greene, A. K. & Seydim, A. C. Review: functional properties of kefir. Crit Rev Food Sci Nutr 51, 261-268, doi:10.1080/10408390903579029 (2011).

5Reagan-Shaw, S., Nihal, M. & Ahmad, N. Dose translation from animal to human studies revisited. FASEB J 22, 659-661, doi:10.1096/fj.07-9574LSF (2008).

6   Milk-derived bioactive peptides and their health promoting effects: a potential role in antherosclersis. Br. J. Clin Pharmacol 83, 152-16, (2017).

7    Involvement of ICAM-1 in the progression of antherosclerosis in POE-knockout mice. Atherosclerosis 160, 305-310, (2002)

8     VCAM-1 in critical in atherosclerosis. J. Clin Invest, 107(10), 1209-1210, (2001)

9     A major role for VCAM-1, but not ICAM-1, in early atherosclerosis. J. Clin Invest, 107(10), 1255-1262, (2001)